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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 8 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)
2016-08-31 發(fā)布 2017-03-01 實(shí)施
中 華 人 民 共 和 國(guó)
國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
發(fā) 布
GB4789. 8 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB / T4789. 8 — 2008 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB / T4789.
8 — 2008 相比,主要變化如下:
———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)”;
———修改了典型菌落的形態(tài)描述;
———?jiǎng)h除了生化鑒定中的商品化名稱;
———描述了血清鑒定的方法。
GB4789. 8 — 2016
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食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(
Yersiniaenterocolitica )的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢驗(yàn)。
2  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  冰箱: 0℃~4℃ 。
2. 2  恒溫培養(yǎng)箱: 26℃±1℃ 、 36℃±1℃ 。
2. 3  顯微鏡: 10 倍 ~100 倍。
2. 4  均質(zhì)器。
2. 5  天平:感量 0. 1g 。
2. 6  滅菌試管: 16mm×160mm 、 15mm×100mm 。
2. 7  滅菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)。
2. 8  錐形瓶: 200mL 、 500mL 。
2. 9  滅菌平皿:直徑 90mm 。
2. 10  微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng)。
3  培養(yǎng)基和試劑
3. 1  改良磷酸鹽緩沖液:見(jiàn) A. 1 。
3. 2 CIN-1 培養(yǎng)基( CepulodinIrgasanNovobiocinAgar ):見(jiàn) A. 2 。
3. 3  改良 Y 培養(yǎng)基( AgarY , Modified ):見(jiàn) A. 3 。
3. 4  改良克氏雙糖培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 4 。
3. 5  糖發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
3. 6  鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 6 。
3. 7  半固體瓊脂:見(jiàn) A. 7 。
3. 8  緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅( MR )和 V-P 試驗(yàn)用]:見(jiàn) A. 8 。
3. 9  堿處理液:見(jiàn) A. 9 。
3. 10  尿素培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 10 。
3. 11  營(yíng)養(yǎng)瓊脂:見(jiàn) A. 11 。
3. 12  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌診斷血清。
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4  檢驗(yàn)程序
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 1 。
圖 1  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)程序
5  操作步驟
5. 1  增菌
以無(wú)菌操作取 25g (或 25mL )樣品放入含有 225mL 改良磷酸鹽緩沖液增菌液的無(wú)菌均質(zhì)杯或均
質(zhì)袋內(nèi),以 8000r / min 均質(zhì) 1min 或拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1min 。液體樣品或粉末狀樣品,應(yīng)振蕩混勻。
均質(zhì)后于 26℃±1℃ 增菌 48h~72h 。增菌時(shí)間長(zhǎng)短可根據(jù)對(duì)樣品污染程度的估計(jì)來(lái)確定。
5. 2  堿處理
除乳與乳制品外,其他食品的增菌液 0.
5mL 與堿處理液 4. 5mL 充分混合 15s 。
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5. 3  分離
將乳與乳制品增菌液或經(jīng)過(guò)堿處理的其他食品增菌液分別接種于 CIN-1 瓊脂平板和改良 Y 瓊脂
平板, 26℃±1℃ 培養(yǎng) 48h±2h 。典型菌落在 CIN-1 上為深紅色中心,周圍具有無(wú)色透明圈(紅色牛
眼狀菌落),菌落大小為 1mm~2mm ,在改良 Y 瓊脂平板上為無(wú)色透明、不黏稠的菌落。
5. 4  改良克氏雙糖試驗(yàn)
分別挑取 5.
3 中的可疑菌落 3 個(gè) ~5 個(gè),分別接種于改良克氏雙糖鐵瓊脂,接種時(shí)先在斜面劃線,再
于底層穿刺,
26℃±1℃ 培養(yǎng) 24h ,將斜面和底部皆變黃且不產(chǎn)氣的培養(yǎng)物做進(jìn)一步的生化鑒定。
5. 5  尿素酶試驗(yàn)和動(dòng)力觀察
用接種環(huán)挑取一滿環(huán) 5.
4 得到的可疑培養(yǎng)物,接種到尿素培養(yǎng)基中,接種量應(yīng)足夠大,振搖幾秒鐘,
26℃±1℃ 培養(yǎng) 2h~4h 。將尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性菌落分別接種于兩管半固體培養(yǎng)基中,于 26℃±1℃ 和
36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h 。將在 26℃ 有動(dòng)力而 36℃ 無(wú)動(dòng)力的可疑菌培養(yǎng)物劃線接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,進(jìn)行
純化培養(yǎng),用純化物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和生化試驗(yàn)。
5. 6  革蘭氏染色鏡檢
將純化的可疑菌進(jìn)行革蘭染色。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌,有時(shí)呈橢圓或桿狀,
大小為(
0. 8 μ m~3. 0 μ m ) ×0. 8 μ m
5. 7  生化鑒定
5. 7. 1  從 5. 5 中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種生化反應(yīng)管,生化反應(yīng)在 26℃±1℃ 進(jìn)行。小腸
結(jié)腸炎耶爾森氏菌的主要生化特征以及與其他相似菌的區(qū)別見(jiàn)表 1 。
表 1  小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與其他相似菌的生化性狀鑒別表
項(xiàng) 目
小腸結(jié)腸炎
耶爾森氏菌
Yersinia
enterocolitica
中間型耶
爾森氏菌
Yersinia
intermedia
弗氏耶
爾森氏菌
Yersinia
frederiksenii
克氏耶
爾森氏菌
Yersinia
kirstensenii
假結(jié)核耶
爾森氏菌
Yersinia
pseudotuberculosis
鼠疫耶
爾森氏菌
Yersinia
pestis
動(dòng)力(
26℃ ) + + + + + -
尿素酶
+ + + + + -
V-P 試驗(yàn)( 26℃ ) + + + - - -
鳥(niǎo)氨酸脫羧酶
+ + + + - -
蔗糖
d + + - - -
棉子糖
- + - - - d
山梨醇
+ + + + - -
甘露醇
+ + + + + +
鼠李糖
- + + - - +
注: + 陽(yáng)性; - 陰性; d 有不同生化型。
5. 7. 2  如選擇微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統(tǒng),可根據(jù) 5. 6 鏡檢結(jié)果,選擇革蘭陰性球桿
菌菌落作為可疑菌落,從 5.
5 所接種的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取單菌落,使用微生物生化鑒定試劑盒或微生
GB4789. 8 — 2016
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物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
5. 8  血清型鑒定(選做項(xiàng)目)
除進(jìn)行生化鑒定外,可選擇做血清型鑒定。在潔凈的載玻片上加一滴 O 因子血清,將待試培養(yǎng)物
混入其內(nèi),使成為均一性混濁懸液,將玻片輕輕搖動(dòng) 0.
5min~1min ,在黑色背景下觀察反應(yīng)。如在
2min 內(nèi)出現(xiàn)比較明顯的小顆粒狀凝集者,即為陽(yáng)性反應(yīng),反之則為陰性,另用生理鹽水作對(duì)照試驗(yàn),以
檢查有無(wú)自凝現(xiàn)象;具體操作方法可按 GB4789.
4 中沙門氏菌 O 因子血清分型方法進(jìn)行。
6  結(jié)果與報(bào)告
綜合以上及生化特征報(bào)告結(jié)果,報(bào)告 25g (或 25mL )樣品中檢出或未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  改良磷酸鹽緩沖液
A. 1. 1  成分
磷酸氫二鈉 8.
23g
磷酸二氫鈉
1. 2g
氯化鈉
5. 0g
三號(hào)膽鹽
1. 5g
山梨醇
20. 0g
A. 1. 2  制法
將磷酸鹽及氯化鈉溶于蒸餾水中,再加入三號(hào)膽鹽及山梨醇,溶解后校正
pH
至 7.
6 ,分裝試管,于
121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 2 CIN-1 培養(yǎng)基
A. 2. 1  基礎(chǔ)培養(yǎng)基:
胰胨
20. 0g
酵母浸膏
2. 0g
甘露醇
20. 0g
氯化鈉
1. 0g
去氧膽酸鈉
2. 0g
硫酸鎂
0. 01g
瓊脂
12. 0g
蒸餾水
950mL
校正
pH
至 7.
5±0. 1 ,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基于 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 2. 2 Irgasan (二氯苯氧氯酚):可用 95% 的乙醇作溶劑,溶解二苯醚,配成 0.4% 的溶液來(lái)替代
Irgasan ,待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷至 80℃ 時(shí),加入 1mL 混勻。
A. 2. 3  冷至 50℃ 時(shí),加入:
中性紅(
3. 0mg / mL ) 10. 0mL
結(jié)晶紫(
0. 1mg / mL ) 10. 0mL
頭孢菌素(
1. 5mg / mL ) 10. 0mL
新生霉素(
0. 25mg / mL ) 10. 0mL
最后不斷攪拌加入 10.
0mL 的 10% 氯化鍶,傾注平皿。
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A. 3  改良 Y 培養(yǎng)基
A. 3. 1  成分
蛋白胨
15. 0g
氯化鈉
5. 0g
乳糖
10. 0g
草酸鈉
2. 0g
去氧膽酸鈉
6. 0g
三號(hào)膽鹽
5. 0g
丙酮酸鈉
2. 0g
孟加拉紅
40. 0mg
水解酪蛋白
5. 0g
瓊脂
17. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
將 A.
3. 1 中成分混合,校正
pH
至 7.
4±0. 1 。于 121℃ 高壓滅菌 15min ,待冷至 45℃ 左右時(shí),傾注
平皿。
A. 4  改良克氏雙糖培養(yǎng)基
A. 4. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
牛肉膏
3. 0g
酵母膏
3. 0g
山梨醇
20. 0g
葡萄糖
1. 0g
氯化鈉
5. 0g
檸檬酸鐵銨
0. 5g
硫代硫酸鈉
0. 5g
瓊脂
12. 0g
酚紅
0. 025g
蒸餾水
1000mL
A. 4. 2  制法
將酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中,校正
pH
至 7.
4 。加入 0. 2% 的酚紅溶液 12. 5mL ,搖勻,分
裝試管,裝量宜多些,以便得到比較高的底層。 121℃ 高壓滅菌 15min ,放置高層斜面?zhèn)溆谩?br /> A. 5  糖發(fā)酵管
A. 5. 1  成分
牛肉膏
5. 0g
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7
蛋白胨
10. 0g
氯化鈉
3. 0g
磷酸氫二鈉
2. 0g
0. 2% 溴麝香草酚藍(lán)溶液 12. 0mL
蒸餾水
1000mL
A. 5. 2  制法
A. 5. 2. 1  葡萄糖發(fā)酵管按 A. 5. 1 中成分配好后,校正
pH
至 7.
4 ,按 0. 5% 加入葡萄糖,分裝于有一個(gè)倒
置小管的小試管內(nèi),
121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 5. 2. 2  其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后,分裝每瓶 100mL , 121℃ 高壓滅菌 15min 。另將各
種糖類分別配好 10% 溶液,同時(shí)高壓滅菌。將 5mL 糖溶液加入 100mL 培養(yǎng)基內(nèi),以無(wú)菌操作分裝小
試管。蔗糖不純,加熱后會(huì)自行水解者,應(yīng)采用過(guò)濾法除菌。
A. 5. 3  試驗(yàn)方法
從瓊脂斜面上挑取少量培養(yǎng)物接種于 26 ℃±1 ℃ 培養(yǎng),一般觀察 2d~3d 。遲緩反應(yīng)需觀察
14d~30d 。
A. 6  鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基
A. 6. 1  成分
蛋白胨
5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
蒸餾水
1000mL
1. 6% 溴甲酚紫 - 乙醇溶液 1. 0mL
L- 鳥(niǎo)氨酸或 DL- 鳥(niǎo)氨酸 0. 5g / 100mL 或 1g / 100mL
A. 6. 2  制法
除鳥(niǎo)氨酸以外的成分加熱溶解后,分裝,每瓶 100mL ,分別加入鳥(niǎo)氨酸。 L- 鳥(niǎo)氨酸按 0.
5% 加入,
DL- 鳥(niǎo)氨酸按 1% 加入。再校正
pH
至 6.
8 。對(duì)照培養(yǎng)基不加鳥(niǎo)氨酸。分裝于無(wú)菌的小試管內(nèi),每管
0. 5mL ,上面滴加一層液體石蠟, 115℃ 高壓滅菌 10min 。
A. 6. 3  試驗(yàn)方法
從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種,于 26℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h ,觀察結(jié)果。鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性者
由于產(chǎn)堿,培養(yǎng)基呈紫色。陰性者無(wú)堿性產(chǎn)物,但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對(duì)照管為黃色。
A. 7  半固體瓊脂
A. 7. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
牛肉膏
0. 3g
氯化鈉
0. 5g
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8
瓊脂
0. 35g~0. 4g
蒸餾水
100mL
A. 7. 2  制法
將 A.
7. 1 中成分配好,煮沸使溶解,并校正
pH
至 7.
4 。分裝小試管, 121 ℃ 高壓滅菌 15min ,直立
凝固備用。
注:供動(dòng)力觀察、菌種保存、 H 抗原位相變異試驗(yàn)等用。
A. 8  緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅( MR )和 V-P 試驗(yàn)用]
A. 8. 1  成分
磷酸氫二鉀
5. 0g
多胨
7. 0g
葡萄糖
5. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 8. 2  制法
溶化后校正
pH
至 7.
0 ,分裝試管,每管 1mL , 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 8. 3  甲基紅( MR )試驗(yàn)
自瓊脂斜面挑取少量培養(yǎng)物接種本培養(yǎng)基中,于 26 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 2d~5d ,哈夫尼亞菌則應(yīng)在
22℃~25℃ 培養(yǎng)。滴加甲基紅試劑一滴,立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽(yáng)性,黃色為陰性。甲基紅試劑配
法:
10mg 甲基紅溶于 30mL95% 乙醇中,然后加入 20mL 蒸餾水。
A. 8. 4 V-P 試驗(yàn)
用瓊脂培養(yǎng)物接種本培養(yǎng)基中,于 26℃±1℃ 培養(yǎng) 2d~4d 。哈夫尼亞菌則應(yīng)在 22℃~25℃ 培
養(yǎng)。加入 6%α- 萘酚 - 乙醇溶液 0.
5mL 和 40% 氫氧化鉀溶液 0. 2mL ,充分振搖試管,觀察結(jié)果。陽(yáng)性反
應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色,如為陰性,應(yīng)放在 36℃±1℃ 培養(yǎng) 4h 再進(jìn)行觀察。
A. 9  堿處理液
A. 9. 1 0. 5% 氯化鈉溶液
氯化鈉
0. 5g
蒸餾水
100mL
121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 9. 2 0. 5% 氫氧化鉀溶液
氫氧化鉀
0. 5g
蒸餾水
100mL
121℃ 高壓滅菌 15min 。
GB4789. 8 — 2016
9
A. 9. 3  制法
將 0.
5% 氯化鈉及 0. 5% 氫氧化鉀等量混合。
A. 10  尿素培養(yǎng)基
A. 10. 1  成分
尿素
20. 0g
酵母浸膏
0. 1g
磷酸二氫鉀
0. 091g
磷酸氫二鈉
0. 095g
酚紅
0. 01g
蒸餾水
1000mL
A. 10. 2  制法
將 A.
10. 1 中成分于蒸餾水中溶解,校正
pH
至 6.
8±0. 2 。不要加熱,過(guò)濾除菌,無(wú)菌分裝于滅菌小
試管中,每管約為 3mL 。
A. 10. 3  試驗(yàn)方法
挑取瓊脂培養(yǎng)物接種在尿素培養(yǎng)基,
26℃±1℃ 培養(yǎng) 24h 。尿素酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變
為紅色。
A. 11  營(yíng)養(yǎng)瓊脂
A. 11. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉浸膏
3g
氯化鈉
5g
瓊脂
15g
蒸餾水
1000mL
A. 11. 2  制法
將 A.
11. 1 中成分于蒸餾水中溶解,校正
pH
至 7.
3±0. 2 。 121℃ 高壓滅菌 15min 。