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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 10 — 2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會
國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 10 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB4789. 10 — 2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》、
SN / T0172 — 2010 《進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法》、 SN / T2154 — 2008 《進(jìn)出口食品中凝固酶
陽性葡萄球菌檢測方法 兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養(yǎng)基技術(shù)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.
10 — 2010 相比,主要變化如下:
———試驗(yàn)用增菌液統(tǒng)一為 7.
5% 氯化鈉肉湯。
GB4789. 10 — 2016
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌(
Staphylococcusaureus )的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn);第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的
食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù);第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。
2  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  恒溫培養(yǎng)箱: 36℃±1℃ 。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒溫水浴箱: 36℃~56℃ 。
2. 4  天平:感量 0. 1g 。
2. 5  均質(zhì)器。
2. 6  振蕩器。
2. 7  無菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
2. 8  無菌錐形瓶:容量 100mL 、 500mL 。
2. 9  無菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
2. 10  涂布棒。
2. 11 pH 計(jì)或
pH
比色管或精密
pH 試紙。
3  培養(yǎng)基和試劑
3. 1 7. 5% 氯化鈉肉湯:見 A. 1 。
3. 2  血瓊脂平板:見 A. 2 。
3. 3 Baird-Parker 瓊脂平板:見 A. 3 。
3. 4  腦心浸出液肉湯( BHI ):見 A. 4 。
3. 5  兔血漿:見 A. 5 。
3. 6  稀釋液:磷酸鹽緩沖液:見 A. 6 。
3. 7  營養(yǎng)瓊脂小斜面:見 A. 7 。
3. 8  革蘭氏染色液:見 A. 8 。
3. 9  無菌生理鹽水:見 A. 9 。
第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)
4  檢驗(yàn)程序
金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)程序見圖 1 。
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圖 1  金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序
5  操作步驟
5. 1  樣品的處理
稱取 25g 樣品至盛有 225mL7.
5% 氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi), 8000r / min~10000r / min 均質(zhì)
1min~2min ,或放入盛有 225mL7. 5% 氯化鈉肉湯無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min~
2min 。若樣品為液態(tài),吸取 25mL 樣品至盛有 225mL7. 5% 氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適
當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,振蕩混勻。
5. 2  增菌
將上述樣品勻液于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。金黃色葡萄球菌在 7.
5% 氯化鈉肉湯中呈混濁
生長。
5. 3  分離
將增菌后的培養(yǎng)物,分別劃線接種到 Baird-Parker 平板和血平板,血平板 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~
24h 。 Baird-Parker 平板 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h 。
5. 4  初步鑒定
金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為 2mm~3mm ,
顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰
帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清
晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,
且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白
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色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。
5. 5  確證鑒定
5. 5. 1  染色鏡檢:金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約為
0. 5 μ m~1 μ m 。
5. 5. 2  血漿凝固酶試驗(yàn):挑取 Baird-Parker 平板或血平板上至少 5 個可疑菌落(小于 5 個全選),分別接
種到 5mLBHI 和營養(yǎng)瓊脂小斜面,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。
取新鮮配制兔血漿 0.
5mL ,放入小試管中,再加入 BHI 培養(yǎng)物 0. 2mL~0. 3mL ,振蕩搖勻,置
36℃±1℃ 溫箱或水浴箱內(nèi),每半小時觀察一次,觀察 6h ,如呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現(xiàn)
凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌
菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。
結(jié)果如可疑,挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到 5mLBHI ,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~48h ,重復(fù)試驗(yàn)。
5. 6  葡萄球菌腸毒素的檢驗(yàn)(選做)
可疑食物中毒樣品或產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定,應(yīng)按附錄 B 檢測葡萄球
菌腸毒素。
6  結(jié)果與報(bào)告
6. 1  結(jié)果判定:符合 5. 4 、 5. 5 ,可判定為金黃色葡萄球菌。
6. 2  結(jié)果報(bào)告:在 25g ( mL )樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。
第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法
7  檢驗(yàn)程序
金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見圖 2 。
圖 2  金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
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8  操作步驟
8. 1  樣品的稀釋
8. 1. 1  固體和半固體樣品:稱取 25g 樣品置于盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯
內(nèi),
8000r / min~10000r / min 均質(zhì) 1min~2min ,或置于盛有 225mL 稀釋液的無菌均質(zhì)袋中,用拍
擊式均質(zhì)器拍打 1min~2min ,制成 1∶10 的樣品勻液。
8. 1. 2  液體樣品:以無菌吸管吸取 25mL 樣品置于盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形
瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成 1∶10 的樣品勻液。
8. 1. 3  用 1mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 樣品勻液 1mL ,沿管壁緩慢注于盛有 9mL 磷酸鹽
緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用 1 支 1mL
無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成 1∶100 的樣品勻液。
8. 1. 4  按 8. 1. 3 操作程序,制備 10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用 1 次 1mL 無菌吸管或
吸頭。
8. 2  樣品的接種
根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),選擇 2 個 ~3 個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進(jìn)
行 10 倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別吸取 1mL 樣品勻液以 0.
3mL 、 0. 3mL 、 0. 4mL 接種量分別
加入三塊 Baird-Parker 平板,然后用無菌涂布棒涂布整個平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如
Baird-Parker 平板表面有水珠,可放在 25℃~50℃ 的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
8. 3  培養(yǎng)
在通常情況下,涂布后,將平板靜置 10min ,如樣液不易吸收,可將平板放在培養(yǎng)箱 36℃±1℃ 培
養(yǎng) 1h ;等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板,倒置后于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h 。
8. 4  典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)
8. 4. 1  金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為 2 mm~
3mm ,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一
清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈
和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺
些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。
8. 4. 2  選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀釋度 3 個平板所有菌落數(shù)合計(jì)在 20CFU~
200CFU 之間的平板,計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。
8. 4. 3  從典型菌落中至少選 5 個可疑菌落(小于 5 個全選)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。分別做染色鏡檢,血漿凝固
酶試驗(yàn)(見 5.
5 );同時劃線接種到血平板 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 后觀察菌落形態(tài),金黃色葡萄球菌
菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。
9  結(jié)果計(jì)算
9. 1  若只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在 20CFU~200CFU 之間,計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌
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落,按式(
1 )計(jì)算。
9. 2  若最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)小于 20CFU ,計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式( 1 )計(jì)算。
9. 3  若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于 200CFU ,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,計(jì)數(shù)該稀釋
度平板上的典型菌落,按式(
1 )計(jì)算。
9. 4  若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于 200CFU ,而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在
20CFU~200CFU 范圍內(nèi),應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式( 1 )計(jì)算。
9. 5  若 2 個連續(xù)稀釋度的平板典型菌落數(shù)均在 20CFU~200CFU 之間,按式( 2 )計(jì)算。
9. 6  計(jì)算公式
式(
1 ):
T = AB
Cd
…………………………( 1 )
式中:
T ———樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);
A ———某一稀釋度典型菌落的總數(shù);
B ———某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù);
C ———某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);
d ———稀釋因子。
式(
2 ):
T = A
1 B 1 / C 1 + A 2 B 2 / C 2
1. 1 d
………………………( 2 )
式中:
T
———樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);
A 1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);
B 1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù);
C 1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);
A 2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);
B 2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù);
C 2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);
1. 1 ———計(jì)算系數(shù);
d
———稀釋因子(第一稀釋度)。
10  報(bào)告
根據(jù) 9 中公式計(jì)算結(jié)果,報(bào)告每 g ( mL )樣品中金黃色葡萄球菌數(shù),以 CFU / g ( mL )表示;如 T 值為
0 ,則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。
第三法 金黃色葡萄球菌 MPN 計(jì)數(shù)
11  檢驗(yàn)程序
金黃色葡萄球菌 MPN 計(jì)數(shù)檢驗(yàn)程序見圖 3 。
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圖 3  金黃色葡萄球菌 MPN 法檢驗(yàn)程序
12  操作步驟
12. 1  樣品的稀釋
按 8.
1 進(jìn)行。
12. 2  接種和培養(yǎng)
12. 2. 1  根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),選擇 3 個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進(jìn)行
10 倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別接種 1 mL 樣品勻液至 7.5% 氯化鈉肉湯管(如接種量超過
1mL ,則用雙料 7. 5% 氯化鈉肉湯),每個稀釋度接種 3 管,將上述接種物 36℃±1℃ 培養(yǎng), 18h~24h 。
12. 2. 2  用接種環(huán)從培養(yǎng)后的 7. 5% 氯化鈉肉湯管中分別取培養(yǎng)物 1 環(huán),移種于 Baird-Parker 平板 36℃
±1℃ 培養(yǎng), 24h~48h 。
12. 3  典型菌落確認(rèn)
按 8.
4. 1 、 8. 4. 3 進(jìn)行。
13  結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)證實(shí)為金黃色葡萄球菌陽性的試管管數(shù),查 MPN 檢索表(見附錄 C ),報(bào)告每 g ( mL )樣品中金
黃色葡萄球菌的最可能數(shù),以 MPN / g ( mL )表示。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1 7. 5% 氯化鈉肉湯
A. 1. 1  成分
蛋白胨 10.
0g
牛肉膏
5. 0g
氯化鈉
75g
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
將上述成分加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝,每瓶 225mL , 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 2  血瓊脂平板
A. 2. 1  成分
豆粉瓊脂(
pH7. 5±0. 2 ) 100mL
脫纖維羊血(或兔血)
5mL~10mL
A. 2. 2  制法
加熱溶化瓊脂,冷卻至 50℃ ,以無菌操作加入脫纖維羊血,搖勻,傾注平板。
A. 3 Baird-Parker 瓊脂平板
A. 3. 1  成分
胰蛋白胨
10. 0g
牛肉膏
5. 0g
酵母膏
1. 0g
丙酮酸鈉
10. 0g
甘氨酸
12. 0g
氯化鋰(
LiCl · 6H 2 O ) 5. 0g
瓊脂
20. 0g
蒸餾水
950mL
A. 3. 2  增菌劑的配法
30% 卵黃鹽水 50mL 與通過 0. 22 μ m 孔徑濾膜進(jìn)行過濾除菌的 1% 亞碲酸鉀溶液 10mL 混合,保
存于冰箱內(nèi)。
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A. 3. 3  制法
將各成分加到蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
0±0. 2 。分裝每瓶 95mL , 121℃ 高壓
滅菌 15min 。臨用時加熱溶化瓊脂,冷至 50 ℃ ,每 95mL 加入預(yù)熱至 50 ℃ 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑
5mL 搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過 48h 。
A. 4  腦心浸出液肉湯( BHI )
A. 4. 1  成分
胰蛋白質(zhì)胨
10. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鈉(
12H 2 O ) 2. 5g
葡萄糖
2. 0g
牛心浸出液
500mL
A. 4. 2  制法
加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝 16mm×160mm 試管,每管 5mL 置 121℃ , 15min 滅菌。
A. 5  兔血漿
取檸檬酸鈉 3.
8g ,加蒸餾水 100mL ,溶解后過濾,裝瓶,
121℃ 高壓滅菌 15min 。兔血漿制備:取
3. 8% 檸檬酸鈉溶液一份,加兔全血 4 份,混好靜置(或以 3000r / min 離心 30min ),使血液細(xì)胞下降,即
可得血漿。
A. 6  磷酸鹽緩沖液
A. 6. 1  成分
磷酸二氫鉀( KH 2 PO 4 )
34. 0g
蒸餾水
500mL
A. 6. 2  制法
貯存液:稱取 34.
0g 的磷酸二氫鉀溶于 500mL 蒸餾水中,用大約 175mL
的 1mol / L 氫氧化鈉溶
液調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2 ,用蒸餾水稀釋至 1000mL 后貯存于冰箱。
稀釋液:取貯存液 1.25 mL ,用蒸餾水稀釋至 1000 mL ,分裝于適宜容器中, 121 ℃ 高壓滅菌
15min 。
A. 7  營養(yǎng)瓊脂小斜面
A. 7. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
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牛肉膏
3. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂
15. 0g~20. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 7. 2  制法
將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi),加入 15% 氫氧化鈉溶液約 2mL 調(diào)節(jié)
pH
至 7.
3±0. 2 。
加入瓊脂,加熱煮沸,使瓊脂溶化,分裝 13mm×130mm 試管,
121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 8  革蘭氏染色液
A. 8. 1  結(jié)晶紫染色液
A. 8. 1. 1  成分
結(jié)晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20. 0mL
1% 草酸銨水溶液 80. 0mL
A. 8. 1. 2  制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A. 8. 2  革蘭氏碘液
A. 8. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化鉀
2. 0g
蒸餾水
300mL
A. 8. 2. 2  制法
將碘與碘化鉀先行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至 300mL 。
A. 8. 3  沙黃復(fù)染液
A. 8. 3. 1  成分
沙黃
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸餾水
90. 0mL
A. 8. 3. 2  制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A. 8. 4  染色法
a ) 涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染 1min ,水洗。
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b ) 滴加革蘭氏碘液,作用 1min ,水洗。
c ) 滴加 95% 乙醇脫色約 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
d ) 滴加復(fù)染液,復(fù)染 1min ,水洗、待干、鏡檢。
A. 9  無菌生理鹽水
A. 9. 1  成分
氯化鈉 8.
5g
蒸餾水 1000mL
A. 9. 2  制法
稱取 8.
5g 氯化鈉溶于 1000mL
蒸餾水中,
121℃ 高壓滅菌 15min 。
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附 錄 B
葡萄球菌腸毒素檢驗(yàn)
B. 1  試劑和材料
除另有規(guī)定外,所用試劑均為分析純,試驗(yàn)用水應(yīng)符合 GB / T6682 對一級水的規(guī)定。
B. 1. 1 A 、 B 、 C 、 D 、 E 型金黃色葡萄球菌腸毒素分型 ELISA 檢測試劑盒。
B. 1. 2 pH 試紙,范圍在 3. 5~8. 0 ,精度 0. 1 。
B. 1. 3 0. 25mol
/ L 、
pH8. 0 的 Tris 緩沖液:將 121.
1g 的 Tris 溶解到 800mL 的去離子水中,待溫度冷
至室溫后,加 42mL 濃 HCL ,調(diào)
pH
至 8.
0 。
B. 1. 4 pH 7.4 的磷 酸 鹽 緩 沖 液:稱 取 NaH 2 PO 4 · H 2 O0.55g (或 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O0.62g )、
Na 2 HPO 4 · 2H 2 O2. 85g (或 Na 2 HPO 4 · 12H 2 O5. 73g )、 NaCl8. 7g 溶于 1000mL 蒸餾水中,充分混
勻即可。
B. 1. 5  庚烷。
B. 1. 6 10% 次氯酸鈉溶液。
B. 1. 7  腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基
B. 1. 7. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
胰消化酪蛋白 200mg (氨基酸)
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鉀 1.
0g
磷酸二氫鉀 1.
0g
氯化鈣
0. 1g
硫酸鎂
0. 2g
菸酸
0. 01g
蒸餾水
1000mL
pH7. 3±0. 2
B. 1. 7. 2  制法
將所有成分混于水中,溶解后調(diào)節(jié)
pH
,
121℃ 高壓滅菌 30min 。
B. 1. 8  營養(yǎng)瓊脂
B. 1. 8. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉膏
3. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂
15. 0g~20. 0g
蒸餾水
1000mL
B. 1. 8. 2  制法
將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi),加入 15% 氫氧化鈉溶液約 2mL 校正
pH
至 7.
3±0. 2 。
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加入瓊脂,加熱煮沸,使瓊脂溶化。分裝燒瓶,
121℃ 高壓滅菌 15min 。
B. 2  儀器和設(shè)備
B. 2. 1  電子天平:感量 0. 01g 。
B. 2. 2  均質(zhì)器。
B. 2. 3  離心機(jī):轉(zhuǎn)速 3000 g ~5000 g 。
B. 2. 4  離心管: 50mL 。
B. 2. 5  濾器:濾膜孔徑 0. 2 μ m 。
B. 2. 6  微量加樣器: 20 μ L~200 μ L 、 200 μ L~1000 μ L 。
B. 2. 7  微量多通道加樣器: 50 μ L~300 μ L 。
B. 2. 8  自動洗板機(jī)(可選擇使用)。
B. 2. 9  酶標(biāo)儀:波長 450nm 。
B. 3  原理
本方法可用 A 、 B 、 C 、 D 、 E 型金黃色葡萄球菌腸毒素分型酶聯(lián)免疫吸附試劑盒完成。本方法測定的
基礎(chǔ)是酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(
ELISA )。 96 孔酶標(biāo)板的每一個微孔條的 A~E 孔分別包被了 A 、 B 、 C 、 D 、 E
型葡萄球菌腸毒素抗體, H 孔為陽性質(zhì)控,已包被混合型葡萄球菌腸毒素抗體,
F 和 G 孔為陰性質(zhì)控,
包被了非免疫動物的抗體。樣品中如果有葡萄球菌腸毒素,游離的葡萄球菌腸毒素則與各微孔中包被
的特定抗體結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物,其余未結(jié)合的成分在洗板過程中被洗掉;抗原抗體復(fù)合物再與
過氧化物酶標(biāo)記物(二抗)結(jié)合,未結(jié)合上的酶標(biāo)記物在洗板過程中被洗掉;加入酶底物和顯色劑并孵
育,酶標(biāo)記物上的酶催化底物分解,使無色的顯色劑變?yōu)樗{(lán)色;加入反應(yīng)終止液可使顏色由藍(lán)變黃,并終
止了酶反應(yīng);以 450nm 波長的酶標(biāo)儀測量微孔溶液的吸光度值,樣品中的葡萄球菌腸毒素與吸光度值
成正比。
B. 4  檢測步驟
B. 4. 1  從分離菌株培養(yǎng)物中檢測葡萄球菌腸毒素方法
待測菌株接種營養(yǎng)瓊脂斜面(試管 18mm×180mm ) 36℃ 培養(yǎng) 24h ,用 5mL 生理鹽水洗下菌落,
傾入 60mL 產(chǎn)毒培養(yǎng)基中, 36 ℃ 振蕩培養(yǎng) 48h ,振速為 100 次/ min ,吸出菌液離心, 8000r / min
20min ,加熱 100℃ , 10min ,取上清液,取 100 μ L 稀釋后的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。
B. 4. 2  從食品中提取和檢測葡萄球菌毒素方法
B. 4. 2. 1  牛奶和奶粉
將 25g 奶粉溶解到 125mL 、
0. 25M 、 pH8. 0 的 Tris 緩沖液中,混勻后同液體牛奶一樣按以下步驟
制備。將牛奶于 15℃ ,
3500 g 離心 10min 。將表面形成的一層脂肪層移走,變成脫脂牛奶。用蒸餾水
對其進(jìn)行稀釋(
1∶20 )。取 100 μ L 稀釋后的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。
B. 4. 2. 2  脂肪含量不超過 40% 的食品
稱取 10g 樣品絞碎,加入 pH7.
4 的 PBS 液 15mL 進(jìn)行均質(zhì)。振搖 15min 。于 15℃ , 3500 g 離心
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10min 。必要時,移去上面脂肪層。取上清液進(jìn)行過濾除菌。取 100 μ L 的濾出液進(jìn)行試驗(yàn)。
B. 4. 2. 3  脂肪含量超過 40% 的食品
稱取 10g 樣品絞碎,加入 pH7.
4 的 PBS 液 15mL 進(jìn)行均質(zhì)。振搖 15min 。于 15℃ , 3500 g 離心
10min 。吸取 5mL 上層懸浮液,轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中,再加入 5mL 的庚烷,充分混勻 5min 。于
15℃ , 3500 g 離心 5min 。將上部有機(jī)相(庚烷層)全部棄去,注意該過程中不要?dú)埩舾�烷。將下部�?br /> 相層進(jìn)行過濾除菌。取 100 μ L 的濾出液進(jìn)行試驗(yàn)。
B. 4. 2. 4  其他食品可酌情參考上述食品處理方法。
B. 4. 3  檢測
B. 4. 3. 1  所有操作均應(yīng)在室溫( 20 ℃~25 ℃ )下進(jìn)行, A 、 B 、 C 、 D 、 E 型金黃色葡萄球菌腸毒素分型
ELISA 檢測試劑盒中所有試劑的溫度均應(yīng)回升至室溫方可使用。測定中吸取不同的試劑和樣品溶液
時應(yīng)更換吸頭,用過的吸頭以及廢液處理前要浸泡到 10% 次氯酸鈉溶液中過夜。
B. 4. 3. 2  將所需數(shù)量的微孔條插入框架中(一個樣品需要一個微孔條)。將樣品液加入微孔條的 A~G
孔,每孔 100 μ L 。 H 孔加 100 μ L 的陽性對照,用手輕拍微孔板充分混勻,用黏膠紙封住微孔以防溶液
揮發(fā),置室溫下孵育 1h 。
B. 4. 3. 3  將孔中液體傾倒至含 10% 次氯酸鈉溶液的容器中,并在吸水紙上拍打幾次以確�？變�(nèi)不殘留
液體。每孔用多通道加樣器注入 250 μ L 的洗液,再傾倒掉并在吸水紙上拍干。重復(fù)以上洗板操作 4
次。本步驟也可由自動洗板機(jī)完成。
B. 4. 3. 4  每孔加入 100 μ L 的酶標(biāo)抗體,用手輕拍微孔板充分混勻,置室溫下孵育 1h 。
B. 4. 3. 5  重復(fù) B. 4. 3. 3 的洗板程序。
B. 4. 3. 6  加 50 μ L 的 TMB 底物和 50 μ L 的發(fā)色劑至每個微孔中,輕拍混勻,室溫黑暗避光處孵育
30min 。
B. 4. 3. 7  加入 100 μ L 的 2mol
/ L 硫酸終止液,輕拍混勻,
30min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在 450nm 波長條件下測
量每個微孔溶液的 OD 值。
B. 4. 4  結(jié)果的計(jì)算和表述
B. 4. 4. 1  質(zhì)量控制
測試結(jié)果陽性質(zhì)控的 OD 值要大于 0.
5 ,陰性質(zhì)控的 OD 值要小于 0. 3 ,如果不能同時滿足以上要
求,測試的結(jié)果不被認(rèn)可。對陽性結(jié)果要排除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾。
B. 4. 4. 2  臨界值的計(jì)算
每一個微孔條的 F 孔和 G 孔為陰性質(zhì)控,兩個陰性質(zhì)控 OD 值的平均值加上 0.
15 為臨界值。
示例:陰性質(zhì)控 1=0.
08
陰性質(zhì)控 2=0.
10
平均值 =0.
09
臨界值 =0.
09+0. 15=0. 24
B. 4. 4. 3  結(jié)果表述
OD 值小于臨界值的樣品孔判為陰性,表述為樣品中未檢出某型金黃色葡萄球菌腸毒素; OD 值大
于或等于臨界值的樣品孔判為陽性,表述為樣品中檢出某型金黃色葡萄球菌腸毒素。
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B. 5  生物安全
因樣品中不排除有其他潛在的傳染性物質(zhì)存在,所以要嚴(yán)格按照 GB19489 《實(shí)驗(yàn)室 生物安全通
用要求》對廢棄物進(jìn)行處理。
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附 錄 C
金黃色葡萄球菌最可能數(shù)( MPN )檢索表
每 g ( mL )檢樣中金黃色葡萄球菌最可能數(shù)( MPN )的檢索見表 C. 1 。
表 C.
1  金黃色葡萄球菌最可能數(shù)( MPN )檢索表
陽性管數(shù)
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 置信區(qū)間
下限 上限
0 0 0 <3. 0
—
9. 5
0 0 1 3. 0 0. 15 9. 6
0 1 0 3. 0 0. 15 11
0 1 1 6. 1 1. 2 18
0 2 0 6. 2 1. 2 18
0 3 0 9. 4 3. 6 38
1 0 0 3. 6 0. 17 18
1 0 1 7. 2 1. 3 18
1 0 2 11 3. 6 38
1 1 0 7. 4 1. 3 20
1 1 1 11 3. 6 38
1 2 0 11 3. 6 42
1 2 1 15 4. 5 42
1 3 0 16 4. 5 42
2 0 0 9. 2 1. 4 38
2 0 1 14 3. 6 42
2 0 2 20 4. 5 42
2 1 0 15 3. 7 42
2 1 1 20 4. 5 42
2 1 2 27 8. 7 94
陽性管數(shù)
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 置信區(qū)間
下限 上限
2 2 0 21 4. 5 42
2 2 1 28 8. 7 94
2 2 2 35 8. 7 94
2 3 0 29 8. 7 94
2 3 1 36 8. 7 94
3 0 0 23 4. 6 94
3 0 1 38 8. 7 110
3 0 2 64 17 180
3 1 0 43 9 180
3 1 1 75 17 200
3 1 2 120 37 420
3 1 3 160 40 420
3 2 0 93 18 420
3 2 1 150 37 420
3 2 2 210 40 430
3 2 3 290 90 1000
3 3 0 240 42 1000
3 3 1 460 90 2000
3 3 2 1100 180 4100
3 3 3 >1100 420
—
注 1 :本表采用 3 個稀釋度[ 0. 1g ( mL )、 0. 01g ( mL )和 0. 001g ( mL )]、每個稀釋度接種 3 管。
注 2 :表內(nèi)所列檢樣量如改用 1g ( mL )、 0.
1g ( mL )和 0.
01g ( mL )時,表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍;如改用 0.
01g
( mL )、
0. 001g ( mL )、 0. 0001g ( mL )時,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高 10 倍,其余類推。