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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 30 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 30 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB4789. 30 — 2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏
菌檢驗(yàn)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.
30 — 2010 相比,主要變化如下:
———增加了“第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法”;
———增加了“第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法”;
———修改了范圍。
GB4789. 30 — 2016
1
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(
Listeriamonocytogenes )的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn);第二法適用于單核細(xì)胞增生李
斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù);第三法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌
含量較低( <100CFU /
g )而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù),特別是牛奶、水以
及含干擾菌落計(jì)數(shù)的顆粒物質(zhì)的食品。
2  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 2  恒溫培養(yǎng)箱: 30℃±1℃ 、 36℃±1℃ 。
2. 3  均質(zhì)器。
2. 4  顯微鏡: 10x~100x 。
2. 5  電子天平:感量 0. 1g 。
2. 6  錐形瓶: 100mL 、 500mL 。
2. 7  無菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
2. 8  無菌平皿:直徑 90mm 。
2. 9  無菌試管: 16mm×160mm 。
2. 10  離心管: 30mm×100mm 。
2. 11  無菌注射器: 1mL 。
2. 12  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌( Listeriamonocytogenes ) ATCC19111 或 CMCC54004 ,或其他等效
標(biāo)準(zhǔn)菌株。
2. 13  英諾克李斯特氏菌( Listeriainnocua ) ATCC33090 ,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。
2. 14  伊氏李斯特氏菌( Listeriaivanovii ) ATCC19119 ,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。
2. 15  斯氏李斯特氏菌( Listeriaseeligeri ) ATCC35967 ,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。
2. 16  金黃色葡萄球菌( Staphylococcusaureus ) ATCC25923 或其他產(chǎn) β - 溶血環(huán)金葡菌,或其他等效標(biāo)
準(zhǔn)菌株。
2. 17  馬紅球菌( Rhodococcusequi ) ATCC6939 或 NCTC1621 ,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。
2. 18  小白鼠: ICR 體重 18g~22g 。
2. 19  全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。
3  培養(yǎng)基和試劑
3. 1  含 0. 6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯( TSB-YE ):見 A. 1 。
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3. 2  含 0. 6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂( TSA-YE ):見 A. 2 。
3. 3  李氏增菌肉湯 LB ( LB 1 , LB 2 ):見 A. 3 。
3. 4 1% 鹽酸吖啶黃( acriflavineHCl )溶液:見 A. 3. 2. 1 、 A. 3. 2. 2 。
3. 5 1% 萘啶酮酸鈉鹽( naladixicacid )溶液:見 A. 3. 2. 1 、 A. 3. 2. 2 。
3. 6 PALCAM 瓊脂:見 A. 4 。
3. 7  革蘭氏染液:見 A. 5 。
3. 8 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基:見 A. 6 。
3. 9  緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅( MR )和 V-P 試驗(yàn)用]:見 A. 7 。
3. 10 5%~8% 羊血瓊脂:見 A. 8 。
3. 11  糖發(fā)酵管:見 A. 9 。
3. 12  過氧化氫試劑:見 A. 10 。
3. 13  李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。
3. 14  生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。
3. 15  緩沖蛋白胨水:見 A. 11 。
第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)
4  檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序見圖 1 。
圖 1  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序
GB4789. 30 — 2016
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5  操作步驟
5. 1  增菌
以無菌操作取樣品 25g ( mL )加入到含有 225mLLB
1 增菌液的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)
均質(zhì) 1min~2min ;或放入盛有 225mLLB
1 增菌液的均質(zhì)杯中,以 8000r
/ min~10000r / min 均質(zhì)
1min~2min 。于 30℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±2h ,移取 0. 1mL ,轉(zhuǎn)種于 10mLLB 2 增菌液內(nèi),于 30℃±
1℃ 培養(yǎng) 24h±2h 。
5. 2  分離
取 LB
2 二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和 PALCAM 瓊脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng)
24h~48h ,觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在 PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,
周圍有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征,參照產(chǎn)品說明進(jìn)行
判定。
5. 3  初篩
自選擇性瓊脂平板上分別挑取 3 個(gè) ~5 個(gè)典型或可疑菌落,分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管,于
36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±2h ,同時(shí)在 TSA-YE 平板上劃線,于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h ,然后選擇木
糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
5. 4  鑒定(或選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)等)
5. 4. 1  染色鏡檢:李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌,大小為( 0. 4 μ m~0. 5 μ m ) × ( 0. 5 μ m~2. 0 μ m );用
生理鹽水制成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察,該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。
5. 4. 2  動(dòng)力試驗(yàn):挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體或 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基,于 25 ℃~30 ℃ 培養(yǎng)
48h ,李斯特氏菌有動(dòng)力,在半固體或 SIM 培養(yǎng)基上方呈傘狀生長(zhǎng),如傘狀生長(zhǎng)不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng)
5d ,再觀察結(jié)果。
5. 4. 3  生化鑒定:挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落,進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn),過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù)
進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和 MR-VP 試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表 1 。
5. 4. 4  溶血試驗(yàn):將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為 20 個(gè) ~25 個(gè)小格,挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺
種到血平板上,每格刺種一個(gè)菌落,并刺種陽性對(duì)照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌)和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特氏菌),穿刺時(shí)盡量接近底部,但不要觸到底面,同時(shí)避免瓊脂破裂,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h ,于明亮處觀察,單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯
特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈,英諾克李斯特氏菌無溶血圈,伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪
廓清晰的 β - 溶血區(qū)域,若結(jié)果不明顯,可置 4℃ 冰箱 24h~48h 再觀察。
注:也可用劃線接種法。
5. 4. 5  協(xié)同溶血試驗(yàn) cAMP (可選項(xiàng)目):在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球
菌,挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間,垂直線兩端不要觸及平行線,距離 1mm~
2mm ,同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于
36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h 。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約 2mm 的 β - 溶
血增強(qiáng)區(qū)域,斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域,伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約
5mm~10mm 的“箭頭狀”
β - 溶血增強(qiáng)區(qū)域,英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯,可置
4℃ 冰箱 24h~48h 再觀察。
注: 5%~8% 的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在馬紅球菌一端有溶血增強(qiáng)現(xiàn)象。
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表 1  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別
菌種 溶血反應(yīng) 葡萄糖 麥芽糖
MR-VP
甘露醇 鼠李糖 木糖 七葉苷
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌
(
L . monocytogenes )
+ + + + / + - + - +
格氏李斯特氏菌
(
L . grayi )
- + + + / + + - - +
斯氏李斯特氏菌
(
L . seeligeri )
+ + + + / + - - + +
威氏李斯特氏菌
(
L . welshimeri )
- + + + / + - V + +
伊氏李斯特氏菌
(
L . ivanovii )
+ + + + / + - - + +
英諾克李斯特氏菌
(
L . innocua )
- + + + / + - V - +
注: + 陽性; - 陰性; V 反應(yīng)不定。
5. 5  小鼠毒力試驗(yàn)(可選項(xiàng)目)
將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于 TSB-YE 中,于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h ,
4000r / min 離心 5min ,
棄上清液,用無菌生理鹽水制備成濃度為 10
10 CFU
/ mL 的菌懸液,取此菌懸液對(duì) 3 只 ~5 只小鼠進(jìn)行
腹腔注射,每只 0.
5mL ,同時(shí)觀察小鼠死亡情況。接種致病株的小鼠于 2d~5d 內(nèi)死亡。試驗(yàn)設(shè)單增
李斯特氏菌致病株和滅菌生理鹽水對(duì)照組。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對(duì)小鼠有致
病性。
5. 6  結(jié)果與報(bào)告
綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果,報(bào)告 25g ( mL )樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特
氏菌。
第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法
6  檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序見圖 2 。
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圖 2  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序
7  操作步驟
7. 1  樣品的稀釋
7. 1. 1  以無菌操作稱取樣品 25g ( mL ),放入盛有 225mL 緩沖蛋白胨水或無添加劑的 LB 肉湯的無菌
均質(zhì)袋內(nèi)(或均質(zhì)杯)內(nèi),在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì) 1min~2min 或以 8000r / min~10000r / min 均
質(zhì) 1min~2min 。液體樣品,振蕩混勻,制成 1∶10 的樣品勻液。
7. 1. 2  用 1mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 樣品勻液 1mL ,沿管壁緩慢注于盛有 9mL 緩沖蛋
白胨水或無添加劑的 LB 肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換
用 1 支 1mL 無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成 1∶100 的樣品勻液。
7. 1. 3  按 7. 1. 2 操作程序,制備 10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1 次,換用 1 支 1mL 無菌吸管或
吸頭。
7. 2  樣品的接種
根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇 2 個(gè) ~3 個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),
每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取 1mL 以 0.
3mL 、 0. 3mL 、 0. 4mL 的接種量分別加入 3 塊李斯特氏菌
顯色平板,用無菌 L 棒涂布整個(gè)平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如瓊脂平板表面有水珠,可放
在 25℃~50℃ 的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
7. 3  培養(yǎng)
7. 3. 1  在通常情況下,涂布后,將平板靜置 10min ,如樣液不易吸收,可將平板放在培養(yǎng)箱 36℃±1℃
培養(yǎng) 1h ;等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿,倒置于培養(yǎng)箱,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h 。
7. 4  典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)
7. 4. 1  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說明為準(zhǔn)。
7. 4. 2  選擇有典型單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀釋度 3 個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在
15CFU~150CFU 之間的平板,計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果:
a ) 只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在 15CFU~150CFU 之間且有典型菌落,計(jì)數(shù)該稀釋度平板
上的典型菌落;
b ) 所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 15CFU 且有典型菌落,應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型
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菌落;
c ) 某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于 150CFU 且有典型菌落,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,
應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;
d ) 所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于 150CFU 且有典型菌落,應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型
菌落;
e ) 所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 15CFU~150CFU 之間且有典型菌落,其中一部分小于
15CFU 或大于 150CFU 時(shí),應(yīng)計(jì)數(shù)最接近 15CFU 或 150CFU 的稀釋度平板上的典型菌落。
以上按式(
1 )計(jì)算。
f ) 2 個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在 15CFU~150CFU 之間,按式( 2 )計(jì)算。
7. 4. 3  從典型菌落中任選 5 個(gè)菌落(小于 5 個(gè)全選),分別按 5. 3 、 5. 4 進(jìn)行鑒定。
8  結(jié)果計(jì)數(shù)
T = AB
Cd
…………………………( 1 )
式中:
T ———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù);
A ———某一稀釋度典型菌落的總數(shù);
B ———某一稀釋度確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C ———某一稀釋度用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);
d ———稀釋因子。
T = A
1 B 1 / C 1 + A 2 B 2 / C 2
1. 1 d
…………………………( 2 )
式中:
T ———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù);
A 1
———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);
B 1
———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C 1
———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);
A 2
———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);
B 2
———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);
C 2
———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);
1. 1 ———計(jì)算系數(shù);
d
———稀釋因子(第一稀釋度)。
9  結(jié)果報(bào)告
報(bào)告每 g ( mL )樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌數(shù),以 CFU / g ( mL )表示;如 T 值為 0 ,則以小于
1 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。
第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法
10  檢驗(yàn)程序
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見圖 3 。
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圖 3  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 計(jì)數(shù)程序
11  操作步驟
11. 1  樣品的稀釋
按 7.
1 進(jìn)行。
11. 2  接種和培養(yǎng)
11. 2. 1  根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選取 3 個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),接
種于 10mLLB
1 肉湯,每一稀釋度接種 3 管,每管接種 1mL (如果接種量需要超過 1mL ,則用雙料 LB 1
增菌液)于 30℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±2h 。每管各移取 0.
1mL ,轉(zhuǎn)種于 10mLLB 2 增菌液內(nèi),于 30℃±
1℃ 培養(yǎng) 24h±2h 。
11. 2. 2  用接種環(huán)從各管中移取 1 環(huán),接種李斯特氏菌顯色平板, 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h 。
11. 3  確證試驗(yàn)
自每塊平板上挑取 5 個(gè)典型菌落( 5 個(gè)以下全選),按照 5.
3 、 5. 4 進(jìn)行鑒定。
12  結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性的試管管數(shù),查 MPN 檢索表(見附錄 B ),報(bào)告每 g ( mL )
樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最可能數(shù),以 MPN / g ( mL )表示。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  含 0. 6% 酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯( TSB-YE )
A. 1. 1  成分
胰胨
17. 0g
多價(jià)胨
3. 0g
酵母膏
6. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鉀
2. 5g
葡萄糖
2. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
將上述各成分加熱攪拌溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝, 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 2  含 0. 6% 酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂( TSA-YE )
A. 2. 1  成分
胰胨
17. 0g
多價(jià)胨
3. 0g
酵母膏
6. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鉀
2. 5g
葡萄糖
2. 5g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 2. 2  制法
將上述各成分加熱攪拌溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝, 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 3  李氏增菌肉湯( LB 1 , LB 2 )
A. 3. 1  成分
胰胨
5. 0g
多價(jià)胨
5. 0g
酵母膏
5. 0g
氯化鈉
20. 0g
磷酸二氫鉀
1. 4g
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磷酸氫二鈉
12. 0g
七葉苷
1. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
將上述成分加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝, 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 3. 2. 1  李氏 Ⅰ 液 ( LB 1 ) 225mL 中加入:
1% 萘啶酮酸 (用 0. 05mol
/ L 氫氧化鈉溶液配制) 0.
5mL
1% 吖啶黃 (用無菌蒸餾水配制) 0. 3mL
A. 3. 2. 2  李氏 Ⅱ 液 ( LB 2 ) 200mL 中加入:
1% 萘啶酮酸 0. 4mL
1% 吖啶黃 0. 5mL
A. 4 PALCAM 瓊脂
A. 4. 1  成分
酵母膏
8. 0g
葡萄糖
0. 5g
七葉甙
0. 8g
檸檬酸鐵銨
0. 5g
甘露醇
10. 0g
酚紅
0. 1g
氯化鋰
15. 0g
酪蛋白胰酶消化物
10. 0g
心胰酶消化物
3. 0g
玉米淀粉
1. 0g
肉胃酶消化物
5. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 4. 2  制法
將上述成分加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝, 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 4. 2. 1 PALCAM 選擇性添加劑
多粘菌素 B
5. 0mg
鹽酸吖啶黃
2. 5mg
頭孢他啶
10. 0mg
無菌蒸餾水
500mL
A. 4. 2. 2  制法
將 PALCAM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶化后冷卻到 50℃ ,加入 2mLPALCAM 選擇性添加劑,混勻后傾倒在
無菌的平皿中,備用。
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A. 5  革蘭氏染色液
A. 5. 1  結(jié)晶紫染色液
A. 5. 1. 1  成分
結(jié)晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20. 0mL
1% 草酸銨水溶液 80. 0mL
A. 5. 1. 2  制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A. 5. 2  革蘭氏碘液
A. 5. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化鉀
2. 0g
蒸餾水
300mL
A. 5. 2. 2  制法
將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至 300mL 。
A. 5. 3  沙黃復(fù)染液
A. 5. 3. 1  成分
沙黃
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸餾水
90. 0mL
A. 5. 3. 2  制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A. 5. 4  染色法
A. 5. 4. 1  涂片用火焰固定后滴加結(jié)晶紫染液,作用 1min ,水洗。
A. 5. 4. 2  滴加革蘭氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 5. 4. 3  滴加 95% 乙醇脫色,約 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
A. 5. 4. 4  滴加復(fù)染液,復(fù)染 1min ,水洗、待干、鏡檢。
A. 6 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基
A. 6. 1  成分
胰胨
20. 0g
多價(jià)胨
6. 0g
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硫酸鐵銨
0. 2g
硫代硫酸鈉
0. 2g
瓊脂
3. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 6. 2  制法
將上述各成分加熱混勻,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝小試管, 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 6. 3  試驗(yàn)方法
挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺接種到 SIM 培養(yǎng)基中,于 25℃~30℃ 培養(yǎng) 48h ,觀察結(jié)果。
A. 7  緩沖葡萄糖蛋白胨水( MR 和 VP 試驗(yàn)用)
A. 7. 1  成分
多價(jià)胨
7. 0g
葡萄糖
5. 0g
磷酸氫二鉀
5. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 7. 2  制法
溶化后調(diào)節(jié)
pH
至 7.
0±0. 2 ,分裝試管,每管 1mL , 121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 7. 3  甲基紅( MR )試驗(yàn)
A. 7. 3. 1  甲基紅試劑
A. 7. 3. 1. 1  成分
甲基紅
10mg
95% 乙醇 30mL
蒸餾水
20mL
A. 7. 3. 1. 2  制法
10mg 甲基紅溶于 30mL95% 乙醇中,然后加入 20mL 蒸餾水。
A. 7. 3. 1. 3  試驗(yàn)方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 2d~5d 。滴加甲基紅試劑一
滴,立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性,黃色為陰性。
A. 7. 4 V-P 試驗(yàn)
A. 7. 4. 1 6% α- 萘酚 - 乙醇溶液
成分及制法:取 α- 萘酚 6.
0g ,加無水乙醇溶解,定容至 100mL
。
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A. 7. 4. 2 40% 氫氧化鉀溶液
成分及制法:取氫氧化鉀 40g ,加蒸餾水溶解,定容至 100mL 。
A. 7. 4. 3  試驗(yàn)方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 2d~4d 。加入 6% α- 萘酚 - 乙
醇溶液 0.
5mL 和 40% 氫氧化鉀溶液 0. 2mL ,充分振搖試管,觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出
現(xiàn)紅色,如為陰性,應(yīng)放在 36℃±1℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 1h 再進(jìn)行觀察。
A. 8  血瓊脂
A. 8. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
牛肉膏
0. 3g
氯化鈉
0. 5g
瓊脂
1. 5g
蒸餾水
100mL
脫纖維羊血
5mL~8mL
A. 8. 2  制法
除新鮮脫纖維羊血外,加熱溶化上述各組分,
121℃ 高壓滅菌 15min ,冷到 50℃ ,以無菌操作加入
新鮮脫纖維羊血,搖勻,傾注平板。
A. 9  糖發(fā)酵管
A. 9. 1  成分
牛肉膏
5. 0g
蛋白胨
10. 0g
氯化鈉
3. 0g
磷酸氫二鈉( Na
2 HPO 4 · 12H 2 O ) 2. 0g
0. 2% 溴麝香草酚藍(lán)溶液 12. 0mL
蒸餾水
1000mL
A. 9. 2  制法
A. 9. 2. 1  葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后,按 0. 5% 比例加入葡萄糖,分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管
內(nèi),調(diào)節(jié)
pH
至 7.
4 , 115℃ 高壓滅菌 15min ,備用。
A. 9. 2. 2  其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后,分裝每瓶 100mL , 115℃ 高壓滅菌 15min 。另將各
種糖類分別配好 10% 溶液,同時(shí)高壓滅菌。將 5mL 糖溶液加入于 100mL 培養(yǎng)基內(nèi),以無菌操作分裝
于含倒置小管的小試管中�；虬凑� A.
9. 2. 1 葡萄糖發(fā)酵管的配制方法制備其他糖類發(fā)酵管。
A. 9. 3  試驗(yàn)方法
取適量純培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管,
36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 24h~48h ,觀察結(jié)果,藍(lán)色為陰性,黃色為
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陽性。
A. 10  過氧化氫酶試驗(yàn)
A. 10. 1  試劑
3% 過氧化氫溶液:臨用時(shí)配制。
A. 10. 2  試驗(yàn)方法
用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落,置于潔凈玻璃平皿內(nèi),滴加 3% 過氧化氫溶液 2 滴,觀
察結(jié)果。
A. 10. 3  結(jié)果
于半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性,不發(fā)生氣泡者為陰性。
A. 11  緩沖蛋白胨水( BPW )
A. 11. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鈉( Na
2 HPO 4 · 12H 2 O ) 9. 0g
磷酸二氫鉀
1. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 11. 2  制法
加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 , 121℃ 高壓滅菌 15min 。
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附 錄 B
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)( MPN )檢索表
每 g ( mL )檢樣中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)( MPN )檢索表見表 B. 1 。
表 B.
1  單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最可能數(shù)( MPN )檢索表
陽性管數(shù)
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 置信區(qū)間
下限 上限
陽性管數(shù)
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 置信區(qū)間
下限 上限
0 0 0 <3. 0
—
9. 5 2 2 0 21 4. 5 42
0 0 1 3. 0 0. 15 9. 6 2 2 1 28 8. 7 94
0 1 0 3. 0 0. 15 11 2 2 2 35 8. 7 94
0 1 1 6. 1 1. 2 18 2 3 0 29 8. 7 94
0 2 0 6. 2 1. 2 18 2 3 1 36 8. 7 94
0 3 0 9. 4 3. 6 38 3 0 0 23 4. 6 94
1 0 0 3. 6 0. 17 18 3 0 1 38 8. 7 110
1 0 1 7. 2 1. 3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3. 6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7. 4 1. 3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3. 6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3. 6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4. 5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4. 5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9. 2 1. 4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3. 6 42 3 2 3 290 90 1000
2 0 2 20 4. 5 42 3 3 0 240 42 1000
2 1 0 15 3. 7 42 3 3 1 460 90 2000
2 1 1 20 4. 5 42 3 3 2 1100 180 4100
2 1 2 27 8. 7 94 3 3 3 >1100 420
—
注 1 :本表采用 3 個(gè)稀釋度[ 0. 1g ( mL )、 0. 01g ( mL )和 0. 001g ( mL )]、每個(gè)稀釋度接種 3 管。
注 2 :表內(nèi)所列檢樣量如改用
lg
( mL )、
0. 1g ( mL )和 0. 01g ( mL )時(shí),表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍;如改用 0. 01g
( mL )、
0. 001g ( mL )、 0. 0001g ( mL )時(shí),則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高 10 倍,其余類推。