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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準
GB 5413.14—2010
中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布
2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測定
National food safety standard
Determination of vitamin B12 in foods for infants and young children,
milk and milk products

GB 5413.14—2010
I
前 言
本標準代替GB/T 5413.14-1997《嬰幼兒食品和乳粉 維生素B12的測定》。
本標準與GB/T 5413.14-1997相比，主要變化如下：
——標準名稱改為《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》。
本標準附錄A為規(guī)范性附錄。
本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：
——GB 5413-1985、 GB/T 5413.14-1997。

GB 5413.14—2010
1
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測定
1 范圍
本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測定方法。
本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12 的測定。
2 規(guī)范性引用文件
本標準中引用的文件對于本標準的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本
適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。
3 原理
利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對維生素 B12 的特異性和靈敏性，定量測定出
試樣中維生素 B12 的含量。在測定用培養(yǎng)基中供給除維生素 B12 以外的所有營養(yǎng)成分，這樣微生物生長
產(chǎn)生的透光率就會同標準曲線工作液及未知待測溶液中維生素 B12 的含量相對應(yīng)。 以不同濃度標準溶液
的透光率相對于各濃度水平標準物質(zhì)的濃度繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線即可計算出試樣中維生素 B12
的含量。
4 試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。
4.1 菌株：萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii） ATCC 7830。
4.2 維生素 B12 （Vitamin B12 或 Cyanocobalamin）標準品：分子式 C63H88CoN14O14P，純度≥99%。
4.3 培養(yǎng)基
4.3.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。
4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：見附錄 A。
4.3.3 維生素 B12 測定用培養(yǎng)基：見附錄 A。
注： 一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標簽說明進行配制。
4.4 9 g/L 氯化鈉溶液（生理鹽水）
稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝于具塞試管，每管 10 mL。 121 ℃ 滅菌 15 min。
4.5 乙醇溶液：體積分數(shù)為 25 %。
4.6 無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。
4.7 無水偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）。
4.8 檸檬酸（含一個結(jié)晶水）（C6H8O7•H2O）。
4.9 標準溶液的制備
4.9.1 維生素 B12 貯備液（10 μg /mL）：精確稱取維生素 B12 標準品（4.2），用乙醇溶液（4.5）定容
至維生素 B12 濃度為 10 μg /mL。

GB 5413.14—2010
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4.9.2 維生素 B12 中間液（100 ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）將 5.0 mL 維生素 B12 貯備液（4.9.1）定
容至 500 mL。
4.9.3 維生素 B12 工作液（1 ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）將 5.0 mL 維生素 B12 中間液（4.9.2）定容
至 500 mL。
4.9.4 標準曲線工作液：分別吸取兩個 5 mL 維生素 B12 工作液（4.9.3）于 250mL 和 500mL 容量瓶中，
用水定容至刻度。高濃度溶液的濃度為 0.02 ng/mL；低濃度溶液的濃度為 0.01 ng/mL。
注：所有標準溶液要儲存于冰箱內(nèi)。 4.9.1、 4.9.2 和 4.9.3 保存期三個月， 4.9.4 臨用前配制。
5 儀器和設(shè)備
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
5.1 天平：感量為 0.1 mg。
5.2 pH 計：精度≤0.01。
5.3 分光光度計。
5.4 渦旋混合器。
5.5 離心機：轉(zhuǎn)速≥2000 轉(zhuǎn)/分鐘。
5.6 恒溫培養(yǎng)箱： 36 ℃ ± 1 ℃。
5.7 冰箱： 2 ℃～5 ℃。
5.8 無菌吸管： 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器和吸頭。
5.9 瓶口分液器： 0 mL～10 mL。
5.10 錐形瓶： 200 mL。
5.11 容量瓶（A 類）： 100 mL， 250 mL， 500 mL。
5.12 單刻度移液管（A 類）：容量 5 mL。
5.13 漏斗：直徑 90 mm。
5.14 定量濾紙：直徑 90 mm。
5.15 試管： 18 mm ×180 mm。
注： 準備玻璃儀器時， 使用活性劑對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗， 清洗之后要求在 200 ℃干熱 2 h。
6 分析步驟
6.1 測試菌液的制備
6.1.1 將萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）的凍干菌株（4.1）活化后， 接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.3.1）
上， 36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng) 24 h。再轉(zhuǎn)種 2 代～3 代來增強活力。置 2 ℃ ～5 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆�。�?15 d 轉(zhuǎn)種一
次。
6.1.2 將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.3.2）中， 36 ℃ ± 1 ℃培養(yǎng) 18 h～24 h，以 2000
轉(zhuǎn)/分鐘離心 2 min～3 min，棄去上清液，加入 10 mL 生理鹽水（4.4），混勻，再離心 2 min～3 min，
棄去上清液，再加入 10 mL 生理鹽水（4.4），混勻。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 mL 生理鹽
水（4.4），混勻。吸適量該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（4.4）中，混勻制成測試菌液。
6.1.3 用分光光度計（5.3），以生理鹽水（4.4）做空白，于 550 nm 波長下測測試菌液（6.1.2）的透
光率，使其透光率在 60 %～80 %之間。
6.2 試樣的處理

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6.2.1 稱取無水磷酸氫二鈉（4.6） 1.3 g，無水偏重亞硫酸鈉（4.7） 1.0 g，檸檬酸（含一個結(jié)晶水）（4.8）
1.2 g，用 100 mL 水溶解。
6.2.2 稱一定量的樣品 (精確到 0.0001 g)， 含維生素 B12 約 50 ng ~100 ng， 用 10 mL 的上述溶液（6.2.1）
混合后，再加 150 mL 水，于 121 ℃ 水解 10 min，冷卻后調(diào) pH 至 4.5 ± 0.2，再用水定容至 250 mL，過
濾。移取濾液 5 mL，加入水 20 mL～30 mL，調(diào) pH 至 6.8 ± 0.2，用水定容至 100 mL。最終溶液中維生
素 B12 的質(zhì)量濃度約在 0.01 ng/mL～0.02 ng/mL，偏重亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度小于 0.03 mg/mL。
6.3 標準曲線的制作
按表 1 順序加入水、標準曲線工作液（4.9.4）和維生素 B12 測定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管中，
一式三份。
表1 標準曲線的制作

試管號	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10
水（mL）	5	5	4	3	2	1	0	2	1	0
0.01 ng/mL標準曲 線工作液（mL）	0	0	1	2	3	4	5	0	0	0
0.02 ng/mL標準曲 線工作液（mL）	0	0	0	0	0	0	0	3	4	5
培養(yǎng)基（mL）	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5

6.4 待測液的制作
按表 2 順序加水、樣品溶液（6.2.2）和維生素 B12 測定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。
表2 待測液的制作

試管號	1	2	3	4
水（mL）	4	3	2	1
待測液（mL）	1	2	3	4
培養(yǎng)基（mL）	5	5	5	5

6.5 滅菌
將 6.3 和 6.4 中所有的試管蓋上試管帽， 121 ℃ 滅菌 5 min（商品培養(yǎng)基按標簽說明進行滅菌）。
6.6 接種
將上述試管迅速冷卻至 30 ℃ 以下。用滴管或移液器向上述試管中各滴加 1 滴（約 50 μL）測試菌
液（6.1.2）（其中標準曲線管中空白 S1 除外）。
6.7 培養(yǎng)
將試管放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)， 36 ℃ ± 1 ℃ 培養(yǎng) 19 h～20 h。
6.8 測定
培養(yǎng)結(jié)束后，對每支試管進行目測檢查，未接種試管 S1 內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則
測定無效。
6.8.1 以接種空白管做對照，測定最高濃度標準曲線試管的透光率， 2 h 后重新測定。兩次結(jié)果透光率
差值若小于 2 %，則取出全部檢驗管測其透光率。
6.8.2 用未接種空白試管（S1）作空白，將分光光度計透光率調(diào)到 100 %（或吸光度為 0），讀出接
種空白試管（S2）的讀數(shù)。再以接種空白試管（S2）為空白，調(diào)節(jié)透光率為 100 %（或吸光度為 0），
依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度）。

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6.8.3 用渦旋混合器（5.4）充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色
皿內(nèi)進行測定，波長為 550 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時間要相同。以維生
素 B12 標準品的含量為橫坐標，透光率為縱坐標作標準曲線。
6.8.4 根據(jù)待測液的透光率，從標準曲線中查得該待測液中維生素 B12 的濃度，再根據(jù)稀釋因子和稱
樣量計算出試樣中維生素 B12 的含量。透光率超出標準曲線管 S 3～S 10 范圍的試樣管要舍去。
6.8.5 對每個編號的待測液的試管，用每支試管的透光率計算每毫升該編號待測液維生素 B12 的濃度，
并計算該編號待測液的維生素 B12 濃度平均值，每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的±15 %，超
過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個編號的待測液的總管數(shù)的 2/3，用于計算試樣含量
的數(shù)據(jù)是不充分的, 需要重新檢驗。如果符合要求的管數(shù)超過原來管數(shù)的 2/3，重新計算每一編號的有
效試樣管中每毫升測定液中維生素 B12 含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值為
Cx。 用于計算試樣中的維生素 B12 含量。
注： 繪制標準曲線，既可讀取透光率（T %），也可讀取吸光度（A）。
7 分析結(jié)果的表述
試樣中維生素 B12 的含量按公式 (1) 計算：
100
1000
= × ×
f
Cm
X x …………………………………………………… (1)
式中：
X——試樣中維生素 B12 的含量，單位為微克每百克表示（μg/100 g）；
Cx——6.8.5 中計算所得的總平均值，單位為納克（ng）；
m ——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
f——稀釋倍數(shù)。
以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
8 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。
9 其他
本標準檢出限為 0.1 μg/100g。

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附錄 A
（規(guī)范性附錄）
培養(yǎng)基和試劑
A.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基
A.1.1 成分
番茄汁 100 mL，三號蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單
油酸酯 1.0 g，瓊脂 14.0 g，水 1000 mL， pH 6.8 ±0.1（25 ℃ ±5 ℃）。
A.1.2 制法
先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH，再加入瓊脂，加熱煮沸至完全溶解�；旌�
均勻后分裝試管，每管 10 mL。 121 ℃ 高壓滅菌 15 min，備用。
A.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基
A.2.1 成分
番茄汁 100 mL，三號蛋白胨 7.5 g，酵母浸膏 7.5 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單
油酸酯 1.0 g，水 1000 mL， pH 6.8 ± 0.1 （25 ℃ ± 5 ℃ ）。
A.2.2 制法
先將上述成分（A.2.1）溶解于水中，調(diào)節(jié) pH，加熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。 121
℃ 高壓滅菌 15 min，備用。
A.3 維生素 B12 測定用培養(yǎng)基
A.3.1 成分
無維生素酸水解酪蛋白 15.0 g，葡萄糖 40.0 g，天門冬酰胺 0.2 g，醋酸鈉 20.0 g，抗環(huán)血酸 4.0 g，
L-胱氨酸 0.4 g， DL-色氨酸 0.4 g，硫酸腺嘌呤 20.0 mg，鹽酸鳥嘌呤 20.0 mg，尿嘧啶 20.0 mg，黃嘌呤
20.0 mg，核黃素 1.0 mg，鹽酸硫胺素 1.0 mg，生物素 10.0 μg，煙酸 2.0 mg， p-氨基苯甲酸 2.0 mg，泛
酸鈣 1.0 mg，鹽酸吡哆醇 4.0 mg，鹽酸吡哆醛 4.0 mg，鹽酸吡哆胺 800.0 μg，葉酸 200.0 μg，磷酸二氫
鉀 1.0 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，硫酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20.0 mg，硫酸亞鐵 20.0 mg，硫酸錳 20.0 mg，聚山
梨糖單油酸酯（吐溫 80） 2.0 g，水 1000 mL， pH 6.0 ± 0.1（25 ℃ ± 5 ℃ ）。
A.3.2 制法
將上述成分溶解于水中，調(diào)節(jié) pH，備用